DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA

Objetivo:

Determinar cuantos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnostico clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal de Hemoglobina.

Fundamento:

La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.

existen varios tipos de hb. en el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:

Hemoglobina A: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal corresponde a mas del 95% del total.

Hemoglobina A´: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.

Hemoglobina F (fetal): consta de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinidad por el oxigeno.

Hemoglobina Gower: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.

La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.

Las distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que determina en un espectrofótometro. La identificación de diferentes formas de la Hb con la determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una manera sencilla.

Material y Equipo:

·         Un espectrofotómetro.

·          Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

·         Pipeta semiautomática

·          Tubos de ensayo.

·         Cubetas cuadradas.

·         Gradilla

·         gasa

Reactivos:

·         EDTA

·         Reactivo Drabkin

·         Ferrocianuro de potasio

·         Cianuro de potasio

·         Bicarbonato de potasio

·         Solución estándar de cianometahemoglobina

Reactivos biológicos:

·         Sangre venosa con EDTA.

Técnica:

1.-En un tubo de ensaye colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin y marcarlo como problema (P).

2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).

 

3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.

4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shalli se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.

5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.

 

6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza  papel parafil para tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es muy peligroso).

 

7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción.

 

8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.

  

9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

Resultados:

Estos fueron los resultados que aperecieron en el espectrofotómetro.

 Muestra 1    
                               
                                                                           

 

Muestra 2

                                                                                                                                              

Cálculos:

Muestra 1

.392/.340 x 15 = 17.29 g/dL

Muestra 2

                                                            .309/.340 x 15 = 13.41 g/ dL

Rango:

normal ya que las 2 muestras fueron realizadas en mujeres.

Cálculos:

Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).

en espectofotometro se aplica la siguiente formula:

muestra/ estandar x 15 = Hb

Valores de referencia:

Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL

Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL

Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL

Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL

Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dL